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什么是噬菌體效價?如何測定?

什么是噬菌體效價?如何測定?

噬菌體效價--------指噬菌體的濃度,即每毫升樣品含噬菌體的個數(shù).通常是在含敏感菌的平板上形成噬菌斑進(jìn)行噬菌體的計數(shù),以每毫升中含有的噬菌斑形成單位(plaque forming unit/ml或pfu/ml)表示其效價.

例如,若每塊平皿加1 l稀釋106倍的樣品,可形成10個噬菌斑,則噬菌體效價為1010pfu/ml.(106*10*1000=1010;1ml=1000ml)

5、 方法

51 噬菌體的檢查

51.1 樣品采集

將2~3g土樣或5mL水樣(如陰溝污水)放入滅菌三角瓶中,加入對數(shù)生長期的敏感指示菌(大腸桿菌(Escherichia coli))菌液3~5mL,再加20mL二倍肉湯蛋白胨培養(yǎng)液。

51.2 增殖培養(yǎng)

30℃振蕩培養(yǎng)12~18h, 使噬菌體增殖。

51.3 離心分離

將上述培養(yǎng)液以3000rpm離心15~20min, 取上清液,用pH7.0,1%蛋白胨水稀釋至10-2~10-3,用于噬菌體檢查及效價測定。

51.4 生物測定法

51.4.1雙層瓊脂平板法

51.4.1.1 倒下層瓊脂

融化下層培養(yǎng)基,倒平板(約10mL/皿)待用。

51.4.1.2倒上層瓊脂

融化上層培養(yǎng)基,待融化的上層培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時,每管中加入敏感指示菌 (大腸桿菌(Escherichia coli)) 菌液0.2mL,待檢樣品液或上述噬菌體增殖液0.2~0.5mL,混合后立即倒入上層平板鋪平。

51.4.1.3恒溫培養(yǎng)

30℃恒溫培養(yǎng)6~12h觀察結(jié)果。

51.4.1.4 觀察結(jié)果

如有噬菌體,則在雙層培養(yǎng)基的上層出現(xiàn)透亮無菌圓形空斑──噬菌斑。

51.4.2 單層瓊脂平板法

省略下層培養(yǎng)基,將上層培養(yǎng)基的瓊脂量增加至2%,融化后冷卻至45℃左右,如同上法加入指示菌和檢樣,混合后迅速倒平板。30℃恒溫培養(yǎng)6~16h后觀察結(jié)果。

51.5 離心分離加熱法(快速檢查)

取大腸桿菌(Escherichia coli)正常培養(yǎng)液和侵染有噬菌體的異常大腸桿菌(Escherichia coli)培養(yǎng)液,4000rpm離心20min,分別取兩組發(fā)酵液的上清液(A1),一部分于721分光光度計上測定OD650光密度值,另外各取5mL上清液于試管中,置水浴中煮沸2min(A2),檢測A2溶液OD650光密度值,記錄結(jié)果。

52 噬菌體效價的測定

52.1 倒平板

將融化后冷卻到45℃左右的下層肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基傾倒于11個無菌培養(yǎng)皿中,每皿約傾注10mL培養(yǎng)基,平放,待冷凝后在培養(yǎng)皿底部注明噬菌體稀釋度。

52.2 稀釋噬菌體

按10倍稀釋法,吸取0.5mL大腸桿菌(Escherichia coli)噬菌體,注入一支裝有4.5mL1%蛋白胨水的試管中,即稀釋到10-1,依次稀釋到10-6稀釋度。

53 噬菌體與菌液混合

將11支滅菌空試管分別標(biāo)記10-4、10-5、10-6和對照。分別從10-4、10-5和10-6噬菌體稀釋液中吸取0.1mL于上述編號的無菌試管中,每個稀釋度平行做三個管,在另外兩支對照管中加0.1mL無菌水,并分別于各管中加入0.2mL大腸桿菌(Escherichia coli)菌懸液,振蕩試管使菌液與噬菌體液混合均勻,置37℃水浴中保溫5min,讓噬菌體粒子充分吸附并侵入菌體細(xì)胞。

54.4 接種上層平板

將11支融化并保溫于45℃的上層肉膏蛋白胨半固體瓊脂培養(yǎng)基5mL分別加入到含有噬菌體和敏感菌液的混合管中,迅速搓勻,立即倒入相應(yīng)編號的底層培養(yǎng)基平板表面,邊倒入邊搖動平板使其迅速地鋪展表面。水平靜置,凝固后置37℃培養(yǎng)。

55 觀察并計數(shù)

觀察平板中的噬菌斑,并將結(jié)果記錄于實驗報告表格內(nèi),選取每皿有30~300個噬菌斑的平板計算噬菌體效價。

計算公式: N=Y/V X

  (N:效價值,Y:平均噬菌斑數(shù)/皿,V:取樣量,X:稀釋度)

例如:當(dāng)稀釋度為10-6時,取樣量為0.1 mL/皿,同一稀釋度中3個平板上的噬菌斑的平均值為186個,則該樣品的效價為:N=186/0.1×10-6=1.86×109。

6、 結(jié)果

61 噬菌體檢查

61.1離心分離加熱法

處理方法 OD650光密度值

正常發(fā)酵液(對照) 異常發(fā)酵液(試驗)

離心上清液(A1)

離心上清液加熱煮沸后(A2)

A2/A1

61.2 繪出平板上的噬菌斑檢測結(jié)果,指出噬菌斑和宿主細(xì)菌。

62 噬菌體效價測定

62.1 平板上噬菌斑數(shù)目

噬菌體稀釋度 10-4 10-5 10-6 對照

噬菌斑數(shù)(個)/皿

平均每皿噬菌斑數(shù)目

62.2 計算噬菌體效價(即噬菌斑形成單位pfu, plague-forming unit).

7、 思考

1、有哪些方法可檢查發(fā)酵液中確有噬菌體存在?比較其優(yōu)缺點。

2、測定噬菌體效價的原理是什么?要提高測定的準(zhǔn)確性應(yīng)注意哪些操作?

3、噬菌體與菌液混合后保溫時間越長其吸附率越高的說法對嗎?

回復(fù)

吸收率:在噬菌體和過量菌液混合后,菌/噬菌體混合液中未感染的噬菌體顆粒經(jīng)過氯仿處理后,在不同時間點檢測其數(shù)量。一般情況下幾分鐘內(nèi)噬菌體即可大部分吸附到宿主菌上.

潛伏期:細(xì)菌與噬菌體混合作用5分鐘后,徹底清洗以除去未結(jié)合的噬菌體。然后用新鮮的培養(yǎng)基重懸至相同體積。該重懸液在370C下孵育,其間有規(guī)則地收集噬菌體測滴度。

裂解量指的是單個宿主細(xì)菌被噬菌體完全裂解后所釋放的噬菌體數(shù)量.具體檢測方法本人也不是很清楚.